产品介绍

【产品描述】

  偶联 anti-Myc tag 纳米抗体的磁珠用于免疫沉淀 Myc tag（EQKLISEEDL）的融合蛋白。

【产品优势】

. 没有普通抗体的轻链和重链；

. 高亲和力：解离常数达到 nM-pM 级别；

. 高载量：20μl 的 slurry 可以结合 8-12μg Myc tag 的蛋白；

. 较短的孵育时间，结合 30-120 min 即可；

【应用范围】

  可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色质免疫沉淀（ChIP）/RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）、

酶活性测定、质谱分析等；

【特异性】

  可以结合 Myc tag 的融合蛋白。

【产品特性】

存储缓冲液：PBS(含有 20%乙醇)。

【保存条件】
  可在 4℃保存半年，-20 度保存 1 年， 避免高速离心， 干燥和反复冻融。

【实验原理】

收集细胞：

  每个免疫沉淀反应大约使用 106-107 的哺乳动物细胞（约一个 10 厘米培养皿）表达 Myc tag 的融合蛋白。吸出生长培养基、 向培养皿中加入 2 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，利用细胞刮或胰酶消化的方法收集贴壁细胞，细胞转移到离心管，500 g 离心 3 分钟并丢弃上清液。

细胞裂解：

  1．用 500 μl 预冷的裂解缓冲液重悬细胞， 在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂（自备）。对于膜蛋白或核/染色质蛋白，可 使用 RIPA 裂解液，或普通 IP 裂解液结合超声破碎细胞的方法。

  2．把离心管放置在冰上 30 分钟， 可以每 10 分钟充分吹打一次，或者在 4 度旋转混合仪上裂解。

  3．细胞裂解产物在 4℃ , 20,000 g 条件下离心 15 分钟，转移裂解产物到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。注意：此时细胞裂 解产物可以放在-80℃进行长期储存。

平衡珠子：

  4．振荡混匀 Anti-Myc Nanobody Magnetic beads，吸取 20μl slurry 到 500 μl 预冷的裂解缓冲液中，在磁力架上分离磁珠 直到上清变成清亮的状态，丢弃上清液。 （此步骤可选，并建议吸取 20μl slurry 时剪掉枪头的前端）

结合蛋白

  5. 将细胞裂解产物加入到平衡的 Anti-Myc Nanobody Magnetic beads 中（如果未做第 4 步，可在细胞裂解产物中直接加入 20μl slurry），在 4 ℃冷柜中的旋转混合仪上结合 30-120 min。如果需要， 可以延长结合时间，并保存 50 μl 的裂解产物作为 input 进行免疫印迹分析。

  6. 在磁力架上分离磁珠直到上清变成清亮的状态，丢弃上清液。

清洗珠子：

  7. 用 500 μ l 预冷的裂解缓冲液中重悬 Anti-Myc Nanobody Magnetic beads，在磁力架上分离磁珠直到上清变成清亮的状态， 丢弃上清液并重复洗涤 2 次。 （可选：在第二次洗涤的步骤中增加盐浓度到 500 mM）。

洗脱蛋白：

方法一：

  8. 加入 20μl 2X SDS-sample buffer 重悬 Anti-Myc Nanobody Magnetic beads。在95℃条件下加热10 min，把免疫沉淀复

合物从珠子上游离出来，然后在 4℃,2500g 条件下离心 3 分钟收集上清，进行免疫印迹分析。

方法二：

  9. 替代步骤8的可选步骤：加入 50μl 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脱结合的蛋白，建议孵育时间 30 秒，并不断混匀，随后离心，转移上清液到新管中，为了中和酸性的甘氨酸，需添加5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。注意：为了提高洗脱效率可以重复这一步。

  10. 替代步骤8和9的可选步骤： 也可以加入过量的 Myc tag的多肽进行洗脱。