产品介绍

产品规格：

形态： 50% slurry（50%悬浊液）

产品描述：

天然蛋白A（Protein A）是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白，天然蛋白G（Protein G）是一种分离于链球 菌属的细胞表面蛋白，二者功能相似，主要与免疫球蛋白（IgG）的Fc区相互作用，可结合大多数哺乳动物的IgG。Protein A和 Protein G通常共价偶联在固体载体如琼脂糖珠或者磁珠上， 直接用于做免疫沉淀（IP）或免疫共沉淀（CoIP）来进行蛋白 功能相关研究，或者直接装在层析柱上来纯化单克隆或者多克隆抗体。 本产品使用的是改造后的重组Protein A和Protein G，去除了天然蛋白本身的非主要结合域以降低非特异性结合。本产 品同时将蛋白A和蛋白G共价偶联到琼脂糖凝胶微球表面，比单独的蛋白A或者蛋白G有更广的结合范围， 能结合绝大多数物种 的IgG，实用性更高。

产品性质：

 基质： 磁性琼脂糖微球；  配体：重组蛋白 A/G；  载量： 10-15 mg 人 IgG/mL 基质；
 粒径：30-100 µm； pH 稳定范围： 3-10；

应用范围：

可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色质免疫沉淀（ChIP）/RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）、抗体纯化等。

产品特性：

存储缓冲液： 1XPBS(含有 20%乙醇)。 保存条件： 可在 4℃保存 1 年， -20℃保存 2 年，避免高速离心，干燥和反复冻融。

使用方法：
1 蛋白样品的准备：

① 贴壁细胞：取10cm细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS 洗涤 2次，然后加入1 mL细胞裂解液裂解细胞 （如普通 IP 裂解液或弱的RIPA裂解液，使用前加入蛋白酶抑制剂 cocktail）；

② 悬浮细胞：离心收集细胞后，PBS 洗涤1次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解；

③ 动植物组织样本：参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解，植物组织还需要先进行液氮研磨再裂解； ：不同量的细胞，应选用适当裂解液的用量进行裂解（如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或 PBS 适当稀 释， 如果蛋白样品浓度过低，在裂解过程中宜适当减少裂解液的用量），通常裂解液的总蛋白浓度选择在 1.0-2.0 mg/mL范 围内较合适，如果目的蛋白浓度偏低，也可以增加总蛋白用量；

2 去除非特应性结合（可选）：

（1) 取 0.5-1 mL 细胞或组织裂解液，蛋白量约为 1.0-2.0 mg，加入约 1 μg 与免疫沉淀时使用的 IgG 种属相同的普通 IgG 和 20 μL 充分重悬的 rProtein A/G Magrose Beads，4℃旋转混合 1-2 h。

（2) 2500 rpm （约 1000g）离心 5 min，取上清用于后续的免疫沉淀实验。 ：种属相同的 IgG 是指与后续免疫沉淀所用一抗宿主相同的正常 IgG，此步骤可以预先去除样本中与rProtein A/G Magrose Beads 非特异性结合的蛋白，从而降低背景.

3 免疫沉淀操作流程-1：

1）抗体吸附 ① 吹吸或颠倒混匀 rProtein A/G Magrose Beads的悬浊液，每个样品取 20 µL 加到 1.5 mL 离心管中，加入 0.5-1.0 mL 结 合缓冲液（也可用细胞裂解液或者 PBS）重悬，磁力架吸附 1 min，吸弃上清。

② 向上述已平衡的 beads 中加入 0.5-1.0 mL 结合缓冲液，并加入 1-5 µg 正常的 IgG 或目的蛋白的抗体，在 4 度条件下， 于旋转混合仪混匀结合 1-2h 后，磁力架吸附1 min，收集 beads 备用，最后剩余少许 buffer 以防止beads干掉。

2）免疫沉淀反应

① 抗原结合：向上述已经结合好抗体的 beads 中加入含抗原的样品（含目的蛋白的细胞或者组织裂解液） ，用移液器轻轻 吹打或者颠倒混匀使 beads 在细胞裂解液中分散均匀，然后在 4℃条件下，置于旋转混合仪上轻轻翻转1-2 h，使抗原与 抗体充分结合，如果结合力较弱，则可结合过夜。

② 洗杂：将上述完成抗原结合的产物磁力架吸附 1 min，收集上清液置于冰上待检测 （也可直接舍弃不检测）。向离心管 中加入 1 mL 洗杂缓冲液（也可直接用细胞裂解液洗杂），与 beads 混匀后，在4 度旋转混合仪上洗5-10 分钟，磁力架 吸附 1 min，弃上清，并重复洗涤 2 次，最后一次尽量吸干净 buffer。

3’免疫沉淀操作流程-2：

1.抗原和抗体的结合： 将IgG或者抗体分别与含有目的蛋白的细胞或者组织裂解液混合，4℃孵育至少2h，或者4℃孵育过夜。 ：孵育时间取决于目的蛋白与抗体的结合效率以及目的蛋白的稳定性，需根据具体情况进行优化；抗体的加入量需 参考后续加入凝胶（beads）的量，一般推荐加入1-5 µg IgG或目的蛋白抗体。

2.凝胶准备： 取20 µl rProtein A/G Magrose Beads加入到1.5 mL 离心管中，加入0.5-1.0 mL结合缓冲液（也可用细胞裂解液或者PBS） 重悬， 磁力架吸附1 min，吸弃上清。

3. 抗原-抗体混合物的吸附： 将含有抗原-抗体复合物的裂解液加入到已平衡的凝胶中，在4℃条件下，置于旋转混合仪轻轻翻转1-2h，使其充分接触 并吸附，磁力架吸附1 min，收集上清留待检测（也可直接舍弃不检测）。

4.洗杂： 向离心管中加入 1 mL 洗杂缓冲液（也可直接用细胞裂解液洗杂） ，与 beads 混匀后，在 4 度旋转混合仪上洗 5-10 分钟， 磁力架吸附 1 min，弃上清，并重复洗涤 2 次，最后一次尽量吸干净 buffer。

4 样品洗脱

1） 变性洗脱（该方法适于 SDS-PAGE 检测） ： 向上述离心管中加入 20-40 μL 1×SDS-PAGE loading buffer 混匀， 95℃加热 5 min。1000 rpm 离心1 min，收集上 清进行后续 WB 分析。

2） 非变性洗脱（该方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后续功能分析）： 向上述免疫沉淀反应得到的 Beads 中加入 50μl 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脱结合的蛋白，建议孵育时间 30 秒-2min，并 不断混匀，室温下手动轻弹混匀或于旋转混合仪轻轻翻转，1000 rpm 离心 1 min，吸取上清，将其收集至新的离心管中， 即为目标蛋白复合物，立即加入 5μl 的中和液 1.0 M Tris（pH10.4），将 pH 调至 7.0-8.0，备用