产品介绍

【实验步骤】

     收集细胞：
     每个免疫沉淀反应大约使用106-107的哺乳动物细胞（约一个10厘米培养皿）表达HA tag的融合蛋白。吸出生长培养基、向培养皿中加入2毫升预冷的 PBS洗涤细胞2次，利用细胞刮或胰酶消化的方法收集贴壁细胞，细胞转移到离心管，500g离心3-5分钟并丢弃上清液。

     细胞裂解：
    1．用1.0mL预冷的裂解缓冲液重悬细胞，在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂（自备）。对于膜蛋白或核/染色质蛋白，可使用RIPA裂解液，或普通IP裂解液结合超声破碎细胞的方法。

     2．把离心管放置在冰上30分钟，可以每10分钟充分吹打一次，或者在4度旋转混合仪上裂解。

     3．细胞裂解产物在4℃,20,000 g条件下离心15分钟，转移裂解产物到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。
注意：此时细胞裂解产物可以放在-80℃进行长期储存。

     平衡珠子：
     4．振荡混匀Anti-HA-Nanoabody-Agarose Beads，吸取20μl slurry到500μl预冷的裂解缓冲液中，在 4℃,2,500 g条件下离心3分钟，丢弃上清液。（此步骤可选，并建议吸取20μl slurry时剪掉枪头的前端）

     结合蛋白：
     5. 将细胞裂解产物加入到平衡的Anti-HA-Nanoabody-Agarose Beads中（如果未做第4步，可在细胞裂解产物中直接加入20μlslurry），在4℃冷柜中的旋转混合仪上结合30-120 min，也可以根据需要延长结合时间。如果需要，保存50μl的裂解产物作为input进行免疫印迹分析。

     6. 在4℃,2500 g条件下离心3分钟，丢弃上清液。

     清洗珠子：
     7. 用1.0 mL预冷的裂解缓冲液中洗涤Anti-HA-Nanoabody-Agarose Beads，在4 ℃旋转混合洗涤5 min，在4℃,2,500 g条件下离心3分钟，丢弃上清液并重复洗涤 2 次。（可选：在第二次洗涤的步骤中增加盐浓度到500mM）。


     洗脱蛋白：
     方法一：
     8. 加入 20μl 2X SDS-sample buffer 重悬 Anti-HA-Nanoabody-Agarose Beads。在 95℃条件下加热 10 min，把免疫沉淀复合 物从珠子上游离出来，然后在 4 ℃, 2,500 g 条件下离心3分钟收集上清，进行免疫印迹分析。

     方法二：

     9. 替代步骤 8 的可选步骤：加入 50μl 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脱结合的蛋白，建议孵育时间 30 秒，并不断混匀，随后离心，转移上清液到新管中，为了中和酸性的甘氨酸，需添加 5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。
注意：为了提高洗脱效率可以重复这一步。

     方法三：

         10. 替代步骤 8 或 9 的可选步骤： 也可以加入过量的 HA tag 的多肽进行洗脱。