产品介绍
品牌 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
KEL Biotech | KC1373-001 | Anti-mCherry Nanobody Magnetic beads | 1ml |
KEL Biotech | KC1373-500ul | Anti-mCherry Nanobody Magnetic beads | 500ul |
【产品描述】
偶联 anti-mCherry 纳米抗体的磁性琼脂糖珠用于免疫沉淀 mCherry 融合蛋白。
【产品优势】
. 没有普通抗体的轻链和重链;
. 高亲和力:解离常数达到 nM-pM 级别;
. 高载量:20μl 的 slurry 可以结合 15-20μg mCherry 蛋白;
. 较短的孵育时间,结合 5-30 min 即可;
【应用范围】
可用于免疫沉淀(IP)/免疫共沉淀(CoIP)、染色质免疫沉淀(ChIP)/RNA 结合蛋白免疫沉淀(RIP)、
酶活性测定、质谱分析等;
【特异性】
可以结合 mCherry,DsRed 等红色荧光蛋白。
【产品特性】
存储缓冲液:PBS(含有 20%乙醇)。
【保存条件】
可在 4℃保存半年,-20 度保存 1 年, 避免高速离心, 干燥和反复冻融。
【实验原理】
收集细胞:
每个免疫沉淀反应大约使用 106-107 的哺乳动物细胞(约一个 10 厘米培养皿)表达 mCherry 的融合蛋白。吸出生长培养基、 向培养皿中加入 2 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次,利用细胞刮或胰酶消化的方法收集贴壁细胞,细胞转移到离心管,500 g 离心 3 分钟并丢弃上清液。
细胞裂解:
1.用 1.0 mL 预冷的裂解缓冲液重悬细胞, 在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂(自备) 。对于膜蛋白或核/染色质蛋白,可使 用 RIPA 裂解液,或普通 IP 裂解液结合超声破碎细胞的方法。
2.把离心管放置在冰上 30 分钟, 可以每 10 分钟充分吹打一次,或者在 4 度旋转混合仪上裂解。
3.细胞裂解产物在 4℃ , 20,000 g 条件下离心 15 分钟,转移裂解产物到一个新的预冷管中,丢弃沉淀。注意:此时细胞裂 解产物可以放在-80℃进行长期储存。
平衡珠子:
4.振荡混匀 Anti-mCherry Nanobody Magnetic beads,吸取 20μl slurry 到 500 μl 预冷的裂解缓冲液中,在磁力架上分离磁珠 直到上清变成清亮的状态,丢弃上清液。 (此步骤可选,并建议吸取 20μl slurry 时剪掉枪头的前端)
结合蛋白
5. 将细胞裂解产物加入到平衡的 Anti-mCherry Nanobody Magnetic beads 中(如果未做第 4 步,可在细胞裂解产物中直接加入 20μl slurry),在 4 ℃冷柜中的旋转混合仪上结合 5-30 min。如果需要, 可以延长结合时间,并保存 50 μl 的裂解产物作为 input 进行免疫印迹分析。
6. 在磁力架上分离磁珠直到上清变成清亮的状态,丢弃上清液。
清洗珠子:
7. 用 1.0 mL 预冷的裂解缓冲液中重悬 Anti-mCherry Nanobody Magnetic beads,在 4 ℃旋转混合洗涤 5 min,在磁力架上分离磁 珠直到上清变成清亮的状态,丢弃上清液并重复洗涤 2 次。 (可选:在第二次洗涤的步骤中增加盐浓度到 500 mM)。
洗脱蛋白:
方法一:
8. 加入 20μl 2X SDS-sample buffer 重悬 mCherry-Nanoab-Magnetic Beads。在 95℃条件下加热 10 min,把免疫沉淀复 合物从珠子上游离出来,然后在 4 ℃, 2,500 g 条件下离心 3 分钟收集上清, 进行免疫印迹分析。
方法二:
9. 替代步骤 8 的可选步骤: 加入 50μl 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脱结合的蛋白,建议孵育时间 30 秒,并不断混匀, 随后 离心,转移上清液到新管中, 为了中和酸性的甘氨酸, 需添加 5μl 1.0 M Tris(pH10.4)。注意:为了提高洗脱效率可以 重复这一步。
【推荐使用溶液】
货号 | 产品名称 | 产品规格 | 组分 | 储存温度 | 有效期 |
KC2360-120ml | Washing Buffer | 120ml | 50 mM Tris-HCl pH 7.5 ;150 mM NaCl;1 mM EDTA | 4℃ | 2年 |
KC3360-60ml | Lysis Buffer | 60ml | 50 mM Tris-HCl pH 7.5 ;150 mM NaCl;;1% Triton-100;1 mM EDTA | 4℃ | 2年 |
KC4360-1ml | 4x Sample Buffer | 1ml | 120 mM Tris-HCl pH 6.8 ;20% glycerol;4% SDS;0.04% Bromophenol blue;10% β-mercaptoethanol | 4℃ | 2年 |
KC5360-60ml | RIPA buffer | 60ml | 10 mM Tris-HCl pH 7.5 ;150 mM NaCl;0.5 mM EDTA;0. 1% SDS; 1% Triton X-100;1% Deoxycholate | 4℃ | 2年 |
KC6360-1ml | Acidic elution buffer (甘氨酸溶液) | 1ml | 200 mM glycine pH 2.5 | 4℃ | 2年 |
KC7360-1ml | Neutralization buffer(中和buffer) | 1ml | 1 M Tris-HCl pH 10.4 | 4℃ | 2年 |
规格/储存条件/有效期
规格 | 1ml |
储存条件 | 4℃ |
有效期 | 24个月 |
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