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磁珠
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规格/储存条件/有效期
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产品介绍


品牌

货号

产品名称

规格

KEL Biotech

KC1373-001

Anti-mCherry Nanobody Magnetic beads

1ml

KEL Biotech

KC1373-500ul

Anti-mCherry Nanobody Magnetic beads

500ul

 

【产品描述】

  偶联 anti-mCherry 纳米抗体的磁性琼脂糖珠用于免疫沉淀 mCherry 融合蛋白。

【产品优势】

. 没有普通抗体的轻链和重链;

. 高亲和力:解离常数达到 nM-pM 级别;

. 高载量:20μl 的 slurry 可以结合 15-20μg mCherry 蛋白;

. 较短的孵育时间,结合 5-30 min 即可;

【应用范围】

  可用于免疫沉淀(IP)/免疫共沉淀(CoIP)、染色质免疫沉淀(ChIP)/RNA 结合蛋白免疫沉淀(RIP)、

酶活性测定、质谱分析等;

【特异性】

  可以结合 mCherry,DsRed 等红色荧光蛋白。

【产品特性】

  存储缓冲液:PBS(含有 20%乙醇)。

【保存条件】
  可在 4℃保存半年,-20 度保存 1 年, 避免高速离心, 干燥和反复冻融。

【实验原理】

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 收集细胞:

  每个免疫沉淀反应大约使用 106-107 的哺乳动物细胞(约一个 10 厘米培养皿)表达 mCherry 的融合蛋白。吸出生长培养基、 向培养皿中加入 2 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次,利用细胞刮或胰酶消化的方法收集贴壁细胞,细胞转移到离心管,500 g 离心 3 分钟并丢弃上清液。

 细胞裂解:

1.用 1.0 mL 预冷的裂解缓冲液重悬细胞, 在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂(自备) 。对于膜蛋白或核/染色质蛋白,可使 用 RIPA 裂解液,或普通 IP 裂解液结合超声破碎细胞的方法。

2.把离心管放置在冰上 30 分钟, 可以每 10 分钟充分吹打一次,或者在 4 度旋转混合仪上裂解。

3.细胞裂解产物在 4℃ , 20,000 g 条件下离心 15 分钟,转移裂解产物到一个新的预冷管中,丢弃沉淀。注意:此时细胞裂 解产物可以放在-80℃进行长期储存。

 平衡珠子:

4.振荡混匀 Anti-mCherry Nanobody Magnetic beads,吸取 20μl slurry 到 500 μl 预冷的裂解缓冲液中,在磁力架上分离磁珠 直到上清变成清亮的状态,丢弃上清液。 (此步骤可选,并建议吸取 20μl slurry 时剪掉枪头的前端)

 结合蛋白

5. 将细胞裂解产物加入到平衡的 Anti-mCherry Nanobody Magnetic beads 中(如果未做第 4 步,可在细胞裂解产物中直接加入 20μl slurry),在 4 ℃冷柜中的旋转混合仪上结合 5-30 min。如果需要, 可以延长结合时间,并保存 50 μl 的裂解产物作为 input 进行免疫印迹分析。

6. 在磁力架上分离磁珠直到上清变成清亮的状态,丢弃上清液。

 清洗珠子:

7. 用 1.0 mL 预冷的裂解缓冲液中重悬 Anti-mCherry Nanobody Magnetic beads,在 4 ℃旋转混合洗涤 5 min,在磁力架上分离磁 珠直到上清变成清亮的状态,丢弃上清液并重复洗涤 2 次。 (可选:在第二次洗涤的步骤中增加盐浓度到 500 mM)。

 洗脱蛋白:

 方法一:

8. 加入 20μl 2X SDS-sample buffer 重悬 mCherry-Nanoab-Magnetic Beads。在 95℃条件下加热 10 min,把免疫沉淀复 合物从珠子上游离出来,然后在 4 ℃, 2,500 g 条件下离心 3 分钟收集上清, 进行免疫印迹分析。

 方法二:

9. 替代步骤 8 的可选步骤: 加入 50μl 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脱结合的蛋白,建议孵育时间 30 秒,并不断混匀,  随后 离心,转移上清液到新管中, 为了中和酸性的甘氨酸, 需添加 5μl 1.0 M Tris(pH10.4)。注意:为了提高洗脱效率可以 重复这一步。

推荐使用溶液】

货号产品名称产品规格组分储存温度有效期
KC2360-120mlWashing Buffer120ml50 mM Tris-HCl pH 7.5 ;150 mM NaCl;1 mM EDTA4℃2年
KC3360-60mlLysis Buffer60ml50 mM Tris-HCl pH 7.5 ;150 mM NaCl;;1% Triton-100;1 mM EDTA4℃2年
KC4360-1ml4x Sample Buffer1ml120 mM Tris-HCl pH 6.8 ;20% glycerol;4% SDS;0.04% Bromophenol blue;10% β-mercaptoethanol4℃2年
KC5360-60mlRIPA buffer60ml10 mM Tris-HCl pH 7.5 ;150 mM NaCl;0.5 mM EDTA;0. 1% SDS; 1% Triton X-100;1% Deoxycholate4℃2年
KC6360-1mlAcidic elution buffer (甘氨酸溶液)1ml200 mM glycine pH 2.54℃2年
KC7360-1mlNeutralization buffer(中和buffer)1ml1 M Tris-HCl pH 10.44℃2年

 

规格/储存条件/有效期

规格

1ml

储存条件4℃
有效期24个月










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