产品介绍

【产品描述】

        偶联 anti-Flag tag 纳米抗体的磁性琼脂糖珠用于免疫沉淀 Flag tag（DYKDDDDK）的融合蛋白。

【产品优势】

      . 没有普通抗体的轻链和重链；

      . 高亲和力：解离常数达到nM-pM级别；

      . 高载量：20μl 的 slurry 可以结合10-15μg Flag tag的融合蛋白；

      . 较短的孵育时间，结合 30-120 min即可；

【应用范围】

       可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色质免疫沉淀（ChIP）/RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性测定、质谱分析等；

【特异性】

       可以结合Flag tag的融合蛋白。

【产品特性】

      存储缓冲液：PBS(含有 20%乙醇)。

      保存条件： 可在 4℃保存半年，-20度保存1年，避免高速离心，干燥和反复冻融。

【实验原理】

收集细胞：

每个免疫沉淀反应大约使用 106-107 的哺乳动物细胞（约一个 10 厘米培养皿） 表达 Flag tag 的融合蛋白。吸出生长培养基、 向培养皿中加入 2 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，利用细胞刮或胰酶消化的方法收集贴壁细胞，细胞转移到离心管，500 g 离心 3 分钟并丢弃上清液。

细胞裂解：

1．用 1.0 mL 预冷的裂解缓冲液重悬细胞， 在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂（自备） 。对于膜蛋白或核/染色质蛋白，可使 用 RIPA 裂解液，或普通 IP 裂解液结合超声破碎细胞的方法。

2．把离心管放置在冰上 30 分钟， 可以每 10 分钟充分吹打一次，或者在 4 度旋转混合仪上裂解。

3．细胞裂解产物在 4℃ , 20,000 g 条件下离心 15 分钟，转移裂解产物到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。注意：此时细胞裂 解产物可以放在-80℃进行长期储存。

平衡珠子：

4．振荡混匀 Flag tag-Nanoab-Magnetic Beads，吸取 20μl slurry 到 500 μl 预冷的裂解缓冲液中，在磁力架上分离磁 珠直到上清变成清亮的状态，丢弃上清液。 （此步骤可选，并建议吸取 20μl slurry 时剪掉枪头的前端）

结合蛋白

5. 将细胞裂解产物加入到平衡的 Flag tag-Nanoab-Magnetic Beads 中（如果未做第 4 步，可在细胞裂解产物中直接加入 20μl slurry），在 4 ℃冷柜中的旋转混合仪上结合 30-120 min。如果需要， 可以延长结合时间，并保存 50 μl 的裂解产物作为 input 进行免疫印迹分析。

6. 在磁力架上分离磁珠直到上清变成清亮的状态，丢弃上清液。

清洗珠子：

7. 用 1.0 mL 预冷的裂解缓冲液中重悬 Flag tag-Nanoab-Magnetic Beads，在 4 ℃旋转混合洗涤 5 min，在磁力架上分离磁 珠直到上清变成清亮的状态，丢弃上清液并重复洗涤 2 次。 （可选：在第二次洗涤的步骤中增加盐浓度到 500 mM）。

洗脱蛋白：

方法一：

8. 加入 20μl 2X SDS-sample buffer 重悬 Flag tag-Nanoab-Magnetic Beads。在 95℃条件下加热 10 min，把免疫沉淀复

合物从珠子上游离出来，然后在 4 ℃, 2,500 g 条件下离心 3 分钟收集上清， 进行免疫印迹分析。

方法二：

9. 替代步骤 8 的可选步骤： 加入 50μl 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脱结合的蛋白，建议孵育时间 30 秒，并不断混匀，  随后 离心，转移上清液到新管中， 为了中和酸性的甘氨酸， 需添加 5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。注意：为了提高洗脱效率可以 重复这一步。

10. 替代步骤 8 和 9 的可选步骤： 也可以加入过量的 Flag tag 的多肽进行洗脱。