产品介绍

  偶联 anti-mCherry 纳米抗体的琼脂糖珠用于免疫沉淀 mCherry 融合蛋白。

【产品优势】

. 没有普通抗体的轻链和重链；

. 高亲和力：解离常数达 nM-pM 级别；

. 高载量：20μl 的 slurry 可以结合 15-20μg mCherry 蛋白；

. 较短的孵育时间，结合 5-30 min 即可；

【应用范围】

  可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色质免疫沉淀（ChIP）/RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）、

酶活性测定、质谱分析等；

【特异性】

  可以结合 mCherry，DsRed 等红色荧光蛋白。

【产品特性】

  存储缓冲液：PBS(含有 20%乙醇)。

【保存条件】
  可在 4℃保存半年，-20℃保存1年，避免高速离心，干燥和反复冻融。

【实验原理】

【收集细胞】：

  每个免疫沉淀反应大约使用 106-107 的哺乳动物细胞（约一个 10 厘米培养皿）表达 mCherry 融合蛋白。吸出生长培养基、向 培养皿中加入 2 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，利用细胞刮或胰酶消化的方法收集贴壁细胞，细胞转移到离心管，500 g 离 心 3-5 分钟并丢弃上清液。

【细胞裂解】：

1．用 1.0 mL 预冷的裂解缓冲液重悬细胞，在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂（自备） 。对于膜蛋白或核/染色质蛋白，可使 用 RIPA 裂解液，或普通 IP 裂解液结合超声破碎细胞的方法。

2．把离心管放置在冰上30 分钟，可以每 10 分钟充分吹打一次，或者在4度旋转混合仪上裂解。

3．细胞裂解产物在 4℃ , 20,000 g条件下离心15分钟，转移裂解产物到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。
注意：此时细胞裂解产物可以放在-80℃进行长期储存。

【平衡珠子】：

4．振荡混匀Anti-mCherry  Nanobody   Agarose  beads ，吸取20μl slurry到500 μl 预冷的裂解缓冲液中，在4 ℃, 2,500 g 条件下离心3分钟，丢弃上清液。（此步骤可选，并建议吸取20μl slurry时剪掉枪头的前端）

【结合蛋白】

5. 将细胞裂解产物加入到平衡的Anti-mCherry  Nanobody   Agarose  beads ，中（如果未做第 4 步，可在细胞裂解产物中直接加入20μl slurry），在 4 ℃冷柜中的旋转混合仪上结合 5-30 min，也可以根据需要延长结合时间。如果需要，保存 50 μl 的裂解产物作为input进行免疫印迹分析。

6. 在 4 ℃, 2,500 g 条件下离心3分钟，丢弃上清液。

【清洗珠子】：

7. 用 1.0 mL 预冷的裂解缓冲液中洗涤Anti-mCherry Nanobody Agarose beads，在 4 ℃旋转混合洗涤 5 min，然后在 4 ℃, 2,500 g 条件下离心 3 分钟，丢弃上清液并重复洗涤 2 次。 （可选：在第二次洗涤的步骤中增加盐浓度到 500 mM）。

【洗脱蛋白】：

 方法一：

8. 加入 20μl 2X SDS-sample buffer 重悬Anti-mCherry Nanobody Agarose beads。在 95℃条件下加热 10 min，把免疫沉淀复合

物从珠子上游离出来，然后在 4 ℃, 2,500 g 条件下离心 3 分钟收集上清， 进行免疫印迹分析。

 方法二：

9. 替代步骤 8 的可选步骤： 加入 50μl 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脱结合的蛋白，建议孵育时间 30 秒，并不断混匀，随后 离心， 转移上清液到新管中，为了中和酸性的甘氨酸，需添加 5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。 
注意：为了提高洗脱效率可以重复这一步。

【推荐使用溶液】