产品介绍

产品描述

  KEL Biotech猪小肠类器官培养基套装（Porcine Intestine Organoid Kit）是一款用于建立和维持猪肠道成体干细胞 来源的小肠类器官培养基套装，该试剂盒提供 了完整的从小肠隐窝分离及培养的全套试剂。猪小肠类器官培养体系模 拟了细胞体内生长的微环境，极大程度维持了来源于体内小肠组织的特征,适用于猪小肠组织来源类器官的构建、维持 培养及传代扩增。
 

产品信息

其他自备材料和试剂

试剂到货处理：

  1.  猪小肠类器官培养基：  在 4  ℃可保存 3 个月，收到货后 4  ℃保存，建议 1 个月内使用完毕，长期不用建议放于 -20  ℃储存，避免反复冻融超过 2 次。

  2.组织保存液、猪小肠原代组织消化液： 内含有维持细胞活性营养成分，为了保持试剂营养成分的活性，长期不用 建议放于-20  ℃储存，避免反复冻融超过 2 次。

使用说明

   猪来源的小肠类器官的建立

  1.使用镊子去除肠道外部的肠系膜、血管和脂肪，将肠段放入 10 cm 培养皿中，培养皿置于冰盒上，加入 2 mL 预冷 DPBS，使用 DPBS  轻轻冲洗肠段。用剪刀将肠段纵向切开，肠腔朝上打开，使用预冷 DPBS  反复轻轻洗涤肠段至清洗液澄清；

  2.  准备装有 15 mL 预冷 DPBS 的 50 mL 离心管，用镊子夹住肠段一端，悬挂于离心管口，将肠段剪成 2- 5 mm 小段，使肠段落入管内液体中；

  3.  使用 10 mL 移液管轻轻上下吹打肠道片段数次，静置后轻轻吸出上清液，再次加入 15 mL 预冷DPBS。重复上述步骤 2-3 次，直至上清液澄清；

  4.  消化：用 30 mL 的 DPBS  溶液重悬肠道组织，再加入 300   μL 0.5M EDTA，至 EDTA 的终浓度为 5  mM。置于 4℃/碎冰中，并放置于摇床上， 80 rpm，震荡消化 30-60 min。消化途中取部分悬液于显微镜 下观察肠隐窝情况。（该步骤的消化时间可能会根据标本的情况进行调整）；

  5.清洗：消化完成后，静置待肠段沉淀，弃上清。加入预冷 DPBS，轻柔摇匀，静置后弃上清，重复 2-3 次以去除 EDTA；

  6 重悬：加入 30 mL 预冷的含 0.1%FBS 的 DPBS，涡旋 30s，取上清 70 μm 滤网过滤，收集穿过滤网的组织悬液，记为馏分 1。重复收集 2 次，记为馏分 2 和馏分3； 

  7.收集： 300g  离心力 4℃离心 3min；

  8.计数：弃上清，根据沉淀量使用上皮类器官基础培养基重悬组织沉淀，取 10-20 μL  悬液进行镜检和隐 窝计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，300g  离心力 4℃离心 3min ，弃上清后置于冰上；

  9.用适量的基质胶重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每 10 μL  基质胶悬液包含 100 至 200 个隐窝，重悬后 置于冰上，重悬时间不超过 30s 以避免基质胶过早凝固；

注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

  10.将基质胶和组织细胞的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，每孔 30   μL 左右，避免悬液接触孔板侧 壁；

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

  11.将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 30 min 左右待基质胶凝固；

  12.待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的猪小肠类器官完全培养基，24 孔板每孔 500μL，避免破坏已凝固结构；

  13.将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养；

  14.每 2~3 天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。密切监测类器官生长状态，理想情况 下，猪小肠类器官应在 5 至 7 天内建成。

【注意事项】

  1.  本产品仅供科研使用， 使用前请仔细阅读本说明书；

  2.  本产品仅适用于新鲜获取或在组织保存液中保存 24 h 内的新鲜标本；

  3.  本产品培养结果会受到标本质量、培养条件等因素影响，同时也受到技术员操作习惯、操作环境以及当前细胞生物学技术局限性等限制，因此可能会存在培养失败的情况。