产品介绍

 简易操作手册

目录号

CL1071-01、CL1071-02

产品组成

*线性化载体 ，可与试剂盒提供的线性化片段重组 ，排除实验其他影响因素；  **线性化片段 ，可与试剂盒提供的线性化载体重组 ，排除实验其他影响因素。

保存条件

-20℃保存 12 个月 ，避免反复冻融。

产品简介

pBM16A Toposmart克隆试剂盒利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切 割再连接的特点将片段克隆到载体中。不仅适用于克隆由Pfu 、KOD 、Xerox 、Phusion 和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物，也可克隆由Taq 、Tth和klenTaq等 DNA聚合酶扩增的带A尾的PCR产物。试剂盒中的pBM16A载体为线性化的质粒。可以 用引物对M13F和M13R进行菌落PCR鉴定阳性克隆。

产品特点

⑴连接反应仅需 5 分钟。

⑵适用于平末端PCR产物和带A尾的PCR产物。

⑶载体采用了新的制备工艺，无需蓝白斑筛选

注意事项

⑴片段的选择：各种DNA聚合酶扩增的PCR产物。

⑵引物要求：PCR引物5’端不能进行磷酸修饰，普通商业化引物即可。

操作步骤

1.连接反应

按下表，在一个 0.2ml PCR 管中依次加入

2.反应温度及片段要求

室温下（20-30℃) 放置 0-5 分钟，然后将离心管放置在冰上。如当天不进行转化实验。 请将连接产物置于-20℃保存。

注意：DNA 片段的用量见下表

室温下（20-30℃) 反应时间 5-30 分钟，如果室温较低，推荐使用PCR 仪器控制温度。 可以设置 25℃反应 5 分钟。如果 PCR 产物电泳检测仅有很锐利明亮的条带，无引物二 聚体和非特异性条带存在，可直接取 0.5-1µl PCR 产物原液进行克隆。

3. 阳性对照反应

取 1µl 试剂盒提供的 1kb 长度的对照片段 LacZ 基因α肽片段进行克隆，转化具有α 互补功能的大肠杆菌感受态细胞（如 DH5α,TOP10,Mach1-T1 等）。菌液涂布在含有 IPTG,X-gal 的 LB 氨苄平板上，次日蓝色菌落为阳性克隆，说明有片段插入，白色菌 落为空载体。

4.转化

1.取 5µl 连接产物到 50-100µl 刚刚融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴 2-30 分钟。

2.42℃水浴中热击 30 秒钟。

3.立刻置于冰水浴中2 分钟。

4.加入 300-500µl 无菌的不含抗生素的 SOC 或 LB ，37℃ , 200-250rpm 振荡培养 60 分钟。

注：小于 2kb 片段可以不复苏，直接涂平板。

5. 吸取 200µl 菌液涂布。为了得到更多的菌落，可以先 4000rpm 离心 1 分钟，去掉部 分上清，用移液器轻吹菌体，充分悬浮菌液，取全部菌液涂布，然后 37℃培养过夜（12-16 小时）。

5. 阳性重组子的鉴定

菌落 PCR

（1） 菌落PCR方法鉴定阳性克隆

① 用10μl吸头挑选克隆至预先加有10μl无菌水或LB培养基的PCR管中，吹打混合。

② 25μl PCR反应体系：取2μl细菌悬液为模板、加入5μM  浓度的M13F/M13R各 1μl进行PCR扩增。

③PCR扩增条件：95℃预变性5分钟（裂解细胞，失活核酸酶），94℃变性10秒 钟，55℃退火10秒钟，72℃延伸（根据片段的大小决定延伸时间，通常每 1min/1kb）X秒，30个循环，72℃后延伸5分钟。1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增 结果，有强烈的明显条带的克隆为重组体，与插入片段大小相近（M13F/M13R 引物在克隆位置的两侧，所以PCR扩增出的DNA的长度比插入片段大138bp） 可视为阳性克隆。菌落PCR方法鉴定重组子时一定要设立一个不加菌液的阴性 对照。

（2）测序：用M13F、M13R通用引物对阳性质粒进行测序分析。

6.pBM16A载体图谱

7.常见问题分析

( 1)   重组子克隆菌少，或阳性率低：

(2)   感受态效率低，使用转化效率>5×107cfu/µg 的感受态细胞

(3)   连接反应在低温下（如放碎冰上）操作，应该在室温下操作。

(4)   PCR 片段加入量太多或太少，按照推荐量加入。

(5)   PCR 纯度低，重新扩增或重新纯化 PCR 产物。

(6)   PCR 质量低，切胶时在紫外下照射时间长，需重新制备。

(7)   PCR 扩增结束后，应该再延伸5-10 分钟，确保片段延伸完全。

(8)   转化后没有复苏培养，可以加入 SOC 或 LB ，培养 60 分钟。

(9)   克隆基因可能对宿主菌有毒性，比如某些编码膜蛋白和 DNA 结合蛋白的基因， 某些启动子和调节序列基因，或含有倒置或串联重复序列的基因，选用室温过夜 培养平板，或换用低拷贝质粒载体。

载体序列：

>pBM16A Topo

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